Laudos

Referente:
LAUDO VIRUCIDA,
ENXAGUATÓRIO BUCAL
ANTISSÉPTICO COM GENGIBRE

Vimos por meio desta enviar o relatório do ensaio eficácia a vírus realizado neste laboratório.

1.1. Objetivo
O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade virucida do produto “ENXAGUATÓRIO BUCAL ANTISSÉPTICO COM GENGIBRE” frente ao vírus Coronavírus cepa MHV-3.

1.2. Instalação de Teste e Período de Condução do Estudo:
Os ensaios foram realizados em laboratório de Virologia, NB-2 (Biosafety Level 2), Departamento de Genética, Evolução, Microbiologia e Imunologia Instituto de Biologia/UNICAMP, Campinas- SP- Brasil.

1.3. As datas abaixo representam o período em que o estudo foi conduzido.

4. Resultados:

Tabela 2- Resultado do Teste de citotoxicidade (Dose Máxima Não Tóxica-DMNT) do Produto “ENXAGUATÓRIO BUCAL ANTISSÉPTICO COM GENGIBRE” na diluição 10^1 a 10^10 em DMEM testado em células e sem vírus (item 3.4).

Tabela 3: Controles Interferência, citotoxicidade, e um padrão interno de formaldeído 0,7% Título do Coronavírus Cepa MHV-3, 10^8,25 DICT50/ml *

*Média de 10 diluições do vírus (de 101 a 1010) em 04 repetições
**Média de 10 diluições do vírus (de 101 a 1010), em 04 repetições

Tabela 4 - Resultados in vitro da ação do Produto “ENXAGUATÓRIO BUCAL ANTISSÉPTICO COM GENGIBRE”, testados por diferentes tempos de ação sobre Coronavírus (Cepa MHV-3).

5. Conclusões:

O produto ENXAGUATÓRIO BUCAL ANTISSÉPTICO COM GENGIBRE, pronto para uso e na diluição 1:10, mostraram inativação frente ao Coronavírus testado.
Considerando que houve inativação de 99,99% (redução de infectividade > log 4), pode-se concluir que o produto ENXAGUATÓRIO BUCAL ANTISSÉPTICO COM GENGIBRE pronto para uso, foi eficaz para a inativação de partículas virais, e, portanto, auxilia no combate do grupo Coronavírus, incluindo Coronavírus causador da COVID-19.
A eficácia do ENXAGUATÓRIO BUCAL ANTISSÉPTICO COM GENGIBRE na Diluição 1:10 foi de até 99,9%, a partir dos tempos de 1 e 4 horas. Portanto, é eficaz para o Coronavírus-MHV-3 testado.

Clarice Weis Arns (PhD, Professor)
Laboratório de virologia
Instituto de Biologia/Universidade Estadual de campinas-UNICAMP

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Referente: LAUDO VIRUCIDA, ENXAGUATÓRIO BUCAL ANTISSÉPTICO NATURAL CITRUS
Vimos por meio desta enviar o relatório do ensaio eficácia a vírus realizado neste laboratório.

1. Introdução:
O presente estudo foi conduzido utilizando a metodologia descrita em "BS EN 14476:2013+A2:2019 Incorporating corrigendum August 2019: Chemical disinfectants and antiseptics -Quantitative suspension test for the evaluation of virucidal activity in the medical area - Test method and requirements (Phase 2/Step 1), com adaptações necessárias. O teste in vitro, em laboratório, leva em consideração as condições práticas de aplicação do produto, Incluindo tempo de contato, temperatura e vírus de teste, isto é, condições que podem influenciar sua ação em situações práticas.

1.1. Objetivo
O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade virucida do produto “Referente: LAUDO VIRUCIDA, ENXAGUATÓRIO BUCAL ANTISSÉPTICO NATURAL CITRUS” frente ao vírus Coronavírus cepa MHV-3.

1.3. Pessoal envolvido no Estudo:

2. Materiais e Métodos

2.1. Produto analisado: ENXAGUATÓRIO BUCAL ANTISSÉPTICO NATURAL CITRUS
Princípio Ativo: Cloreto de cetilpiridínio (0,075%)

Lote: AN002/21
Fab: 01/06/21
Val: 01/06/23

Segue a FÓRMULA:

3. Condições experimentais

3.1. Vírus e Célula Utilizadas:

Vírus testados: Coronavírus cepa MHV-3 gênero Betacoronavirus (mesmo gênero e família das espécies SARS-CoV-1, SARS-CoV-2/Covid-19, MERS e outros).

3.2. Multiplicação viral

As células foram cultivadas em garrafas de cultivo celular de 25 cm2 utilizando uma concentração inicial de 1.5×105 células/mL em Meio Essencial Mínimo de Dulbecco (DMEM) Gibco® livre de antibióticos e suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Para a propagação viral, as amostras foram inoculadas nas garrafas de cultivo celular e quando a monocamada apresentar 70% de efeito citopatogênico (CPE) irá proceder-se a raspagem da monocamada e agitação vigorosa até a dissolução dos grumos celulares. Estoques de vírus portando 105,0 doses infectantes para 50% dos cultivos celulares (DICT50) por 200μL foram estocadas a -80°C para uso posterior.

3.3. Titulação viral

Amostra de Coronavírus MHV-3 foi diluída em DMEM, titulada na base 10 (101 a 1010) e inoculada em quadruplicata em microplacas 96 orifícios de cultivo celular com volume de 100 μL/orifício. Em seguida foram adicionados 100 μL de célula na concentração de 1.5×105 células/mL células/orifício às placas que foram incubadas em estufa à 37ºC com 5% de CO2 por até quatro dias, A leitura das placas foi feita em busca do efeito citopático (ECP) característico para cada vírus às respectivas células. O título viral foi definido em doses infectantes para 50% dos cultivos celulares (DICT50) e foi calculado pelo método de Spearman & Kaerber (Muthannan Andavar Ramakrishnan, 2016). Fórmula Spearman & Kaerber.

* CPE: Cytopathic effect (ECP: Efeito citopático provocado pelo vírus nas células)

3.4. Determinação da concentração máxima não tóxica (CMNT)

Para a determinação das concentrações/diluições a serem utilizadas nos testes virucidas foi necessário determinar a concentração máxima que não causa toxicidade para as células. Definir a concentração ideal para realizar a atividade antiviral/virucida, na diluição ideal para realizar o ensaio virucida.
As células foram cultivadas (3.2) em microplacas de 96 orifícios e após a sua aderência foi adicionado 100 L substância teste diluída em água dura em diferentes diluições (10^1 a 10^10), incubadas por 48 horas e o resultado é lido através de microscópio invertido.

3.5. Cálculo e verificação da atividade virucida

A atividade virucida do produto de teste é avaliada calculando a diminuição do título em comparação com a titulação de controle sem o produto. A diferença é dada como fator de redução (FR). Onde: FR= TV-TT (TV: Título de vírus do controle/não tratado e TT: Título de vírus do teste tratado).
De acordo com a EN 144476: 2019, uma solução antisséptica em uma concentração particular tem eficácia de inativação de vírus no título é reduzida em pelo menos quatro log10 dentro do período de exposição recomendado. Isso corresponde a uma inativação de ≥ 99,99%.

3.6. Ensaio virucida:

a) Produto “ENXAGUATÓRIO BUCAL ANTISSÉPTICO NATURAL CITRUS” foi testado na forma pura e 1:10 (CMNT previamente calculadas) foram conduzidos em quadruplicata (quatro repetições biológicas) e diluído em meio MEM sem SFB.

b) Após o ensaio do item (b), o produto ENXAGUATÓRIO BUCAL ANTISSÉPTICO NATURAL CITRUS foi misturado e homogeneizado ao vírus (100DICT) submetido a diferentes tempos de contato (5 e 60 minutos) e titulado de 10^1 a 10^10.

c) As células permissivas (L929), após 24hs de incubação, foram retiradas 100μL (pipeta multicanal) de meio das monocamadas de células aderidas. A seguir foi adicionado 100μL do Produto, nas respectivas CMNT previamente calculadas, em quadruplicata, à monocamada de células e incubadas em estufa à 37o C com 5% de CO2 por até 48 horas. Preparo das células: Para os estudos virucidas foram distribuídas 100μL de célula (L929) nas microplacas de 96 orifícios com uma concentração de 1.5×105 células/mL células/orifício diluída em meio de cultura (DMEM) com 10% de Soro Fetal Bovino. As microplacas foram incubadas em estufa à 37oC com 5% de CO2 por 24 hs para que ocorra aderência das células às placas.
Após transcorridos o período de incubação, as placas foram lidas através do Microscópio Ótico Invertido na busca do Efeito Citopático (ECP) característico do vírus (verifica-se a falta ou não do efeito citopático da infecção viral) e os títulos foram calculados com base no método de Spearman & Kaerber (3.3).
Por fim, os resultados são expressos em percentual inativação viral (Tabela 1) em comparação com o controle viral (título do vírus) não tratado.

d) Os ensaios foram validados por um controle de citotoxicidade, controle de interferência, controle de neutralização e um padrão interno de formaldeído 0,7% que foram conduzidos da mesma forma do produto teste.

4. Resumo/controles:

• Negativo: controle celular (2x105 células/mL) em meio DMEM, sem vírus e sem amostras teste.

• Controle de vírus: Titulação de vírus (101 a 1010 ) e cultura de células em meio DMEM

• Teste positivo: presença de vírus, cada amostra teste e linhagem celular em meio DMEM.

• Controle virucida: Formaldeído a 0,7% e linhagem celular em meio DMEM.

• Controle Citotoxicidade: controle celular (2x105 células/mL) em meio DMEM, sem vírus e com amostras teste.

Tabela 1 - Os resultados são expressos em percentual de inativação viral em comparação com o controle viral não tratado:

https://microchemlab.com/information/log-and-percent-reductions-microbiology-and-antimicrobial-testing

5. Resultados:

Tabela 2- Resultado do Teste de citotoxicidade (Dose Máxima Não Tóxica-DMNT) do a) Produto “ENXAGUATÓRIO BUCAL ANTISSÉPTICO NATURAL CITRUS” na diluição 10^1 a 10^10 em DMEM testado em células (item 3.4).

Tabela 3: Controle Interferência, citotoxicidade, e um padrão interno de formaldeído 0,7% Título do Coronavírus Cepa MHV-3, 10^8,25 DICT50/ml *

*Média de 10 diluições do vírus (de 101 a 1010) em 04 repetições
**Média de 10 diluições do vírus (de 101 a 1010), em 04 repetições

Tabela 4 - Resultados in vitro da ação do a) Produto “ENXAGUATÓRIO BUCAL ANTISSÉPTICO NATURAL CITRUS”, testados por diferentes tempos de ação sobre Coronavírus (Cepa MHV-3).

6. Conclusões:

• O produto ENXAGUATÓRIO BUCAL ANTISSÉPTICO NATURAL CITRUS, PRONTO PARA USO analisado, mostrou inativação frente ao Coronavírus testado.

• Considerando que houve inativação de 99,99% (redução de infectividade > log 4), pode-se concluir que o produto ENXAGUATÓRIO BUCAL ANTISSÉPTICO NATURAL CITRUS foi eficaz para a inativação de partículas virais, e, portanto, auxilia no combate do grupo Coronavírus, incluindo Coronavírus causador da COVID-19.

• Enxaguatório Bucal Antisséptico Natural Citrus na Diluição 1:10 não foi eficaz para o Coronavírus testado.